Genetically encoded fluorescent reporters to visualize α-Synuclein pathology in live brain
2026年5月21日上午，北京脑科学与类脑研究所邀请北京生命科学研究所曹鹏教授作题为“Genetically encoded fluorescent reporters to visualize α-Synuclein pathology in live brain”的学术报告。报告由本所研究员叶一泓主持。
曹鹏博士
北京生命科学研究所高级研究员
曹鹏教授2000年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位；2005年毕业于中国科学院生物物理研究所，获理学博士学位。2005年至2008年在美国贝勒医学院分子生理及生物物理系从事博士后研究。2008年至2012年师从诺贝尔奖得主Thomas Südhof在美国斯坦福大学医学院/霍华德休斯医学研究所从事助理研究员。目前任职于北京生命科学研究所，担任高级研究员。
曹鹏教授致力于大脑感知病源入侵启动防御反应的神经机制研究；此外也聚焦于开发新型分子工具及小鼠模型从而可视化神经退行性疾病相关致病蛋白的病理过程。
本次报告，曹鹏教授重点介绍了其团队于2026年3月发表在《Cell》期刊的学术成果，该研究系统性的开发了基因编码荧光reporters，并结合相应的Knock in（KI）小鼠标记α-Synuclein （α-Syn）包涵体，从而使在活体大脑中观察α-Syn病理传播成为可能。
报告最初，曹鹏教授从帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的病理及临床表现切入。PD是一种常见的神经退行性疾病，其典型临床表现包括运动症状（如动作迟缓）和非运动症状（如嗅觉减退，胃肠功能障碍）。PD的主要病理特征包括黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺神经元的变性丢失；及脑内出现称为路易小体（Lewy bodies）的神经元包涵体；这些包涵体的主要成分是错误折叠的、在丝氨酸129位点发生磷酸化的α-Syn（p-α-Syn）。在动物模型中，脑内注射α-Syn预制纤维（preformed fibrils, PFF），能够诱导内源性α-Syn发生聚集，并模拟Lewy bodies病理改变逐步扩散的过程。鉴于α-Syn在PD中的重要性，其异常聚集及对神经元功能的病理影响已得到广泛研究。然而，由于无法直接观察活体脑组织中的α-Syn包涵体，解析其在大脑中的传播机制以及如何诱发特定神经元发生病理改变等问题仍面临巨大挑战。为克服这一局限，曹鹏教授团队开发了基因编码的荧光报告分子及相应的小鼠KI品系，使得在活体大脑中直接观察α-Syn病理传播成为可能。
曹鹏教授团队将小鼠α-Syn与荧光蛋白（EGFP或tdTomato）通过linker连接，开发用于标记α-Syn inclusions的基因reporters。其中设计了7种不同的linkers并检测哪种linker可以使融合蛋白更为有效特异地报告神经元中的α-Syn inclusions。使用表达这些reporters的慢病毒转染Wild type（WT）海马神经元并加入PFF诱导，细胞免疫荧光（immunocytochemistry，ICC）显示在p-α-Syn阳性的细胞中可以观察到更强的EGFP/tdT信号，而p-α-Syn阴性细胞的EGFP/tdT信号很弱；且6H linker在标记p-α-Syn阳性神经元中特异性和效率最佳。
考虑到reporters有自发聚集的可能，随后对其相关特性进行了检测。虽然in tubo 纯化的reporters能够聚集，但是硫磺素T实验（thioflavin T，ThT assay）结果显示它们的聚集倾向相对较低。且在敲除SNCA（α-Syn的编码基因）的神经元中表达reporters，PFF诱导后p-α-Syn阳性细胞数极少（＜1%），这说明reporters并不能自发形成α-Syn inclusions。
为进一步检测这些reporters是否可以在小鼠脑内标记p-α-Syn阳性包涵体，曹鹏教授团队开发了对应的KI小鼠品系（SNCA-6H-EGFP/tdT）。在杂合KI小鼠CA1区注射PFF后，切片观察reporter可以很好标记p-α-Syn阳性神经元，且与Lewy 小体的其他marker如p62共定位。而在纯合KI小鼠CA1脑区注射PFF并不能观察到p-α-Syn阳性神经元。上述现象在多个不同脑区得到稳定验证，说明reporters可以在小鼠脑内稳定标记示踪内源α-Syn形成的路易小体。
接下来，曹鹏教授团队就reporter KI小鼠是否可以用于观察p-α-Syn阳性包涵体传播进行了探究。额叶联合皮质（frontal association cortex，FrA）注射PFF 28天后，脑组织切片可在FrA区观察到p-α-Syn阳性包涵体，而初级运动皮层（primary motor cortex，M1）并未检测到明显的p-α-Syn阳性包涵体。注射84天后，FrA 和M1区均可观察到p-α-Syn阳性包涵体。上述结果通过Two-photo imaging在活体小鼠也得到了验证。综上，这种工具小鼠可以用于观察α-Syn在脑区间的传播。
之后，曹鹏教授团队利用Ca2+ imaging及电生理技术，发现reporter KI小鼠也是探究α-Syn包涵体对神经元活性影响的有力工具。同以往报道研究相同，显示病理性的包涵体会损伤相应部位的自发神经元活动。
针对现有KI品系缺乏神经元亚型特异性这一问题，曹鹏教授团队构建了 RCL-Snca-6H-EGFP 小鼠品系。该品系可通过 Cre 依赖性的报告基因表达，这确立了 RCL-Snca-6H-EGFP 小鼠品系的应用价值，可实现对分布于不同脑区的特定神经元亚型中的 p-α-Syn阳性包涵体 进行特异性标记。
同时，KI品系小鼠与新型组学技术结合也体现出了极大优势。曹鹏教授团队利用patch-seq approach将细胞电生理与组学分析结合。根据细胞纤维结构及reporter荧光信号分别采集了SNc区α-Syn包涵体阳性和阴性的多巴胺能神经元（dopaminergic neurons）。为阐明α-Syn包涵体对转录过程的病理影响，对α-Syn包涵体阳性与阴性神经元之间的差异表达基因进行基因集富集分析（GSEA），结果表明α-Syn包涵体会扰乱多个细胞组分和生物过程中的基因表达。此外，团队也采用单细胞质谱技术，分析了SNc区多巴胺能神经元的胞质代谢组学。KEGG富集分析结果显示，上调的代谢物富集于甲基组氨酸代谢通路，而下调的代谢物则富集于甘氨酸/丝氨酸代谢、糖酵解以及乳糖降解通路。这些单细胞质谱结果表明，α-Syn包涵体会深刻改变SNc多巴胺能神经元的代谢组。
针对α-Syn包涵体会损伤神经元动作电位发放这一现象，曹鹏教授团队由此提出问题：放电活动是否反过来调控包涵体的形成。4-AP，一种能增强动作电位发放的分子，可抑制α-Syn包涵体的形成。In vivo实验进一步支持了这一结果，小鼠摄入4-AP明显减轻了PFF注射小鼠的运动缺陷。因此，动作电位发放是抑制α-Syn包涵体形成的关键因素。
综上，曹鹏教授团队开发的基因编码荧光reporter支持在活体小鼠脑内研究α-Syn的多种应用。
报告最后，听众对报告内容展开了深入友好的讨论。提出的问题主要包括基因编辑的reporter对内源性α-Syn聚集是否可能产生影响，以及reporter在相关疾病如AD等中的应用前景等。曹鹏教授对以上问题分别进行详细解答。
撰稿人：高梦娇
